Kiểm soát chất lượng xét nghiệm SARS-CoV-2 (2020 – 2021)
Để xác định, điều trị và ngăn chặn SARS-CoV-2, loại virus gây ra COVID-19, các bác sĩ lâm sàng trên toàn thế giới dựa vào các chẩn đoán kịp thời và chính xác. Do sự phát triển với tốc độ nhanh của các bộ dụng cụ thử nghiệm, điều quan trọng là các phòng thí nghiệm phải duy trì các thực hành kiểm soát chất lượng (QC) thận trọng để thiết lập độ tin cậy của kết quả xét nghiệm. Bài viết này nêu một số phương pháp hay được đề xuất để kiểm soát chất lượng khi xét nghiệm SARS-CoV-2. Chú ý cụ thể đến các phương pháp tiếp cận thực tế để sử dụng các giao thức kiểm soát chất lượng cho các phương pháp xét nghiệm khác nhau.
Phương pháp kiểm tra
Hiện có ba phương pháp xét nghiệm khác nhau trong thực tế để xác định xem bệnh nhân có nhiễm virus hay không. Mỗi phương pháp đều dựa trên việc phát hiện trực tiếp RNA của virus hoặc các protein của virus (kháng nguyên), hoặc phát hiện các kháng thể của bệnh nhân, là một phản ứng miễn dịch khi nhiễm virus.
- Các xét nghiệm phân tử được thiết kế để phát hiện sự hiện diện của RNA virus trong dịch mũi hoặc dịch rửa / hút mũi hoặc mũi họng.
- Các xét nghiệm kháng nguyên được thiết kế để phát hiện sự hiện diện của các protein virus trong dịch mũi hoặc dịch rửa / hút dịch mũi hoặc mũi họng.
- Các xét nghiệm huyết thanh hoặc kháng thể được thiết kế để phát hiện sự hiện diện của các globulin miễn dịch của người trong máu.
Kiểm tra phân tử
Xét nghiệm phân tử chủ yếu dựa vào việc phân tích các mẫu dịch mũi / họng hoặc dịch rửa / hút bằng phương pháp PCR. Việc xác định virus dựa trên việc phát hiện các gen cụ thể. Các xét nghiệm phân tử sử dụng một hoặc nhiều gen này để xác định virus.
Khi chọn vật liệu kiểm soát chất lượng cho xét nghiệm phân tử, bạn nên đảm bảo rằng nhiều mục tiêu gen được sử dụng trong xét nghiệm cũng có sẵn trong vật liệu đối chứng. Để phản ứng với việc thử nghiệm tình trạng thiếu nguồn cung cấp, một số phòng thí nghiệm đang xác nhận và chạy nhiều thử nghiệm phân tử để nếu một hệ thống gặp sự cố do thiếu nguồn cung cấp, thì việc thử nghiệm có thể tiếp tục trên hệ thống khác. Trong các tình huống này, việc quản lý hàng tồn kho có thể được sắp xếp hợp lý bằng cách sử dụng một biện pháp kiểm soát có chứa tất cả các mục tiêu gen được bao phủ bởi các xét nghiệm phân tử khác nhau của phòng thí nghiệm.
Vật liệu kiểm soát có sẵn trên thị trường phù hợp với ba loại:
- ARN tổng hợp: Những vật liệu này, với một hoặc nhiều gen đích, được thiết kế bằng cách tạo ra các bản phiên mã ARN tổng hợp, chứa các gen duy nhất. Chúng không lây nhiễm và có thể được định lượng ở nồng độ dương tính thấp.
- Virus bất hoạt hoặc sống: Các phần tử vi rút có thể bị bất hoạt về mặt hóa học hoặc nhiệt để không lây nhiễm. Kiểm soát toàn bộ bộ gen phù hợp với danh mục này.
- DNA plasmid: Tế bào vi khuẩn tinh khiết / nguyên vẹn có chứa trình tự SARS-CoV-2 tổng hợp. Chúng cũng chứa một hoặc nhiều gen mục tiêu.
Một bước quan trọng trong quá trình thử nghiệm là tách chiết hoặc tinh chế RNA của virus từ mẫu sinh học. Các mẫu bệnh phẩm được trộn với chất đệm ly giải để giải phóng vật liệu di truyền. Sau đó, RNA được tách khỏi DNA và các protein khác trong mẫu bằng các thuốc thử chiết xuất cụ thể. Để kiểm tra quy trình chiết xuất này, các kiểm soát chất lượng phải chứa vật liệu di truyền của con người hoặc một lớp áo protein tương tự như virus thực tế. Vật liệu kiểm soát âm tính phải chứa DNA bộ gen người, mô phỏng giống với các mẫu bệnh nhân thực tế và cho phép các phòng thí nghiệm xác nhận hiệu suất của toàn bộ quy trình xét nghiệm phân tử – bao gồm chiết xuất, khuếch đại và phát hiện.
Hầu hết các vật liệu đối chứng hoặc đối chứng là định lượng và có nồng độ được cung cấp trong tờ hướng dẫn sử dụng sản phẩm. Vật liệu định lượng được đặc trưng tốt cũng có thể được sử dụng cho các khía cạnh khác nhau của quá trình xác nhận hoặc xác nhận, chẳng hạn như thiết lập giới hạn phát hiện (nồng độ chất phân tích thấp nhất mà phương pháp thử có thể phát hiện).
Cũng như các quy trình kiểm tra chất lượng theo phương pháp thử nghiệm khác, bạn nên sử dụng các tài liệu kiểm soát chất lượng độc lập của bên thứ ba. Những điều này không chỉ có lợi về hiệu quả nhờ có thể được sử dụng trên nhiều nền tảng, chúng còn cung cấp kiểm tra hiệu suất độc lập, không thiên vị.
Thực hành QC
Để hỗ trợ việc phát triển các thực hành QC hoạt động thực tế, có một số nguồn tài liệu cung cấp hướng dẫn.
Ví dụ, về tần suất, WHO khuyến nghị rằng kiểm tra QC được thực hiện với mỗi lần chạy và đã lưu ý rằng “mỗi lần thực hiện xét nghiệm khuếch đại axit nucleic (NAAT) nên bao gồm cả kiểm soát bên ngoài và bên trong và các phòng thí nghiệm được khuyến khích tham gia vào chất lượng bên ngoài các chương trình đánh giá khi chúng có sẵn.”
Danh sách kiểm tra vi sinh vật học (MIC 65200) của Trường Cao đẳng Bệnh học Hoa Kỳ (CAP) nêu rõ rằng đối với (QC hàng ngày – Thử nghiệm dựa trên phân tử), “các thử nghiệm định lượng và định tính dựa trên phân tử, các kiểm soát được thực hiện ít nhất hàng ngày hoặc thường xuyên hơn nếu được chỉ định trong hướng dẫn, quy trình phòng thí nghiệm hoặc Danh sách kiểm tra CAP, và khi những thay đổi xảy ra có thể ảnh hưởng đến kết quả của bệnh nhân. ” 2
Bản sửa đổi cải tiến phòng thí nghiệm lâm sàng (CLIA) đã cung cấp hướng dẫn QC bổ sung cho thử nghiệm COVID-19 của Ủy quyền sử dụng khẩn cấp (EUA), trong một số điều kiện nhất định cho phép giảm QC mà không yêu cầu IQCP. CAP, Ủy ban hỗn hợp, và các cơ quan kiểm định khác đã làm theo. Tuy nhiên, do độ nhạy của thử nghiệm này, không nên coi nhẹ việc giảm QC. Tuy nhiên, để có kết quả tối ưu, các phòng thí nghiệm nên tuân thủ các hướng dẫn CAP sau đối với QC của thử nghiệm phân tử:
- Kiểm tra định lượng: ít nhất ba lần kiểm soát hàng ngày, bao gồm một kiểm soát âm tính, một kiểm tra dương tính thấp và một kiểm soát dương tính cao.
- Kiểm tra định tính: đối chứng dương tính và âm tính hàng ngày.
Trong khi hầu hết các phương pháp phân tử này được báo cáo định tính, nhiều phương pháp tạo ra kết quả định lượng cơ bản là Định lượng chu trình (Cq) hoặc Ngưỡng chu kỳ (Ct), xác định số chu kỳ mà tại đó đường cong phản ứng của mẫu giao với đường ngưỡng. Giá trị đó sau đó được chuyển thành kết quả định tính cho mục đích báo cáo thử nghiệm. Giá trị kết quả sau đó có thể được đánh giá và sử dụng như một chỉ báo hiệu suất cho thử nghiệm. Các phương pháp định lượng khác cũng có thể tạo ra các giá trị định lượng bổ sung (ví dụ: bản sao / uL).
Khi các kết quả định lượng được tạo ra, các phòng thí nghiệm có thể thiết lập các phương tiện và phạm vi mục tiêu của riêng họ. Mặc dù các phụ liệu sản phẩm có thể cung cấp các giá trị mục tiêu, nhưng thực hành QC tốt yêu cầu phòng thí nghiệm phải thiết lập các mục tiêu của riêng mình. Điều này có thể dễ dàng được thực hiện bằng cách chạy điều khiển ít nhất mười lần trong các ngày hoặc lần chạy khác nhau. 3
Khi đặt phạm vi QC được chấp nhận, một số phòng thí nghiệm có phạm vi riêng được xác định dựa trên kinh nghiệm hoặc sử dụng lâm sàng (ví dụ +/- 3 Ct). Tuy nhiên, như với các quy trình QC định lượng truyền thống, phòng thí nghiệm có thể sử dụng độ lệch chuẩn hiện có (SD) hoặc hệ số biến thiên (CV) từ lô kiểm soát trước đó hoặc thiết lập SD hoặc CV mới bằng cách đo ban đầu 20 kết quả kiểm soát và sau đó cập nhật các kết quả này ước tính khi có thêm kết quả.
Ghi lại kết quả trong biểu đồ Levey-Jennings có thể giúp xác định xu hướng và những thay đổi có thể có trong hiệu suất của phương pháp thử nghiệm. Tăng thêm sự tự tin khi tham gia vào chương trình so sánh ngang hàng và chương trình thử nghiệm thành thạo. Những công cụ này cung cấp thông tin chi tiết, không chỉ cho chính phòng thí nghiệm mà còn về cách một phương pháp thử nghiệm hoặc nhật ký thuốc thử hoạt động trên nhiều phòng thí nghiệm.
Kiểm tra kháng nguyên
Tại thời điểm viết bài này, chỉ có một thử nghiệm được Cục Quản lý Thực phẩm và Dược phẩm Hoa Kỳ (FDA) chấp thuận. Đây là một xét nghiệm nhanh dạng hộp mực sử dụng công nghệ miễn dịch huỳnh quang bánh mì kẹp để xác định kháng nguyên SARS CoV-2.
Như với nhiều bài kiểm tra dòng bên (POC), kiểm tra dòng bên, bài kiểm tra này cung cấp kiểm soát thủ tục tích hợp, nhưng cũng cung cấp kiểm soát chất lượng bên ngoài tích cực và tiêu cực.
Các yêu cầu tối thiểu về kiểm soát chất lượng đối với các xét nghiệm tại điểm chăm sóc thường được quy định như sau:
- Một lần cho mỗi lô mới, hoặc lô hàng mới của bộ dụng cụ, với điều kiện là mỗi lô khác nhau nhận được trong lô hàng đều được kiểm tra.
- Phù hợp với các quy định của địa phương, tiểu bang và liên bang hoặc các yêu cầu công nhận
Kiểm tra kháng thể
Theo hướng dẫn tạm thời của Trung tâm Kiểm soát và Phòng ngừa Dịch bệnh (CDC), hiện tại không có lợi thế nào được xác định của các xét nghiệm cho dù chúng xét nghiệm IgG, IgM và IgA hay kháng thể toàn phần. Các xét nghiệm phát hiện kháng thể liên kết có thể được phân loại qua hai loại chính:
Các xét nghiệm trong phòng thí nghiệm sử dụng phương pháp ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay) hoặc CIA (Chemiluminescent Immunoassay) để phát hiện kháng thể. Dựa trên các thuốc thử, IgG, IgM và IgA có thể được phát hiện riêng biệt hoặc kết hợp làm tổng phân tích kháng thể.
Các xét nghiệm nhanh tại điểm chăm sóc thường là các thiết bị dòng chảy bên phát hiện IgG; IgG và IgM; hoặc tổng số kháng thể hiện diện trong mẫu.
Thực hành QC
Tùy thuộc vào phương pháp được sử dụng và loại kháng thể được phát hiện, các vật liệu kiểm soát khác nhau có sẵn. Khi chạy nhiều xét nghiệm trong phòng thí nghiệm, lợi thế của việc kiểm soát tổng thể kháng thể (IgG, IgM và / hoặc IgA) là nó có thể được sử dụng cho cả xét nghiệm kháng thể tổng thể cũng như xét nghiệm kháng thể cụ thể, giúp đơn giản hóa các vấn đề quản lý hàng tồn kho. Như mong đợi, các kiểm soát kháng thể riêng lẻ chỉ có thể được sử dụng cho xét nghiệm kháng thể cụ thể, được chỉ định.
Một số bộ dụng cụ có thể bao gồm vật liệu kiểm soát của riêng chúng (ví dụ phương pháp ELISA) được yêu cầu để xác minh rằng các thử nghiệm được thực hiện theo quy trình và / hoặc được sử dụng để lấy giá trị ngưỡng thử nghiệm. Như tài liệu tham khảo điều khoản phụ 5.6.2.2 của ISO 15189: 2012 (E), “Việc sử dụng vật liệu kiểm soát của bên thứ ba độc lập nên được xem xét, thay vì hoặc bổ sung, bất kỳ vật liệu kiểm soát nào do nhà sản xuất thuốc thử hoặc dụng cụ cung cấp. Phòng thí nghiệm phải sử dụng các tài liệu kiểm soát chất lượng phản ứng với hệ thống kiểm tra theo cách càng gần với mẫu bệnh phẩm càng tốt. ”
Theo CLSI-C24-A4, “lợi thế khi tham gia chương trình QC liên phòng là: Xác minh rằng phòng thí nghiệm đang tạo ra kết quả QC phù hợp với các phòng thí nghiệm khác sử dụng cùng quy trình đo và do đó chứng minh rằng phòng thí nghiệm đang sử dụng quy trình đo một cách chính xác. ”
Một khía cạnh khác cần xem xét đối với cả xét nghiệm phân tử và huyết thanh học là xác nhận QC liên quan đến “xét nghiệm theo lô, trong đó tồn tại mối tương quan trực tiếp giữa chất lượng của xét nghiệm vật liệu kiểm soát và xét nghiệm mẫu bệnh phẩm trong đợt. Với trường hợp khác , trong đó từng mẫu bệnh phẩm được kiểm tra riêng lẻ, không còn mối tương quan trực tiếp giữa chất lượng của mẫu đối chứng và chất lượng của mẫu bệnh phẩm tiếp theo ”. 6 Lấy mẫu bệnh phẩm bằng mẫu QC là một trong những giải pháp được sử dụng nhiều nhất cho các nền tảng xét nghiệm rời rạc.
Phần kết luận
Với tình hình khẩn cấp hiện nay và các xét nghiệm và phương pháp mới đang được phê duyệt thông qua sự cho phép sử dụng khẩn cấp từ FDA, điều quan trọng là phải kiểm soát một cách thận trọng việc thực hiện các xét nghiệm chẩn đoán và giám sát. Với sự phát triển và sản xuất nhanh hơn, logic quy định rằng các giao thức QC cần được củng cố để đảm bảo các vấn đề về hiệu suất được xác định và giải quyết nhanh chóng. Thực hành kiểm soát chất lượng tốt tiêu chuẩn cho các phương pháp phân tử và huyết thanh học chắc chắn áp dụng cho các xét nghiệm SARS-CoV-2 mới.
Khi sử dụng các phương pháp thử nghiệm khác nhau trong phòng thí nghiệm, việc lựa chọn một sản phẩm kiểm soát chất lượng có thể hoạt động cho nhiều lần thử nghiệm có thể có lợi. Lựa chọn vật liệu kiểm soát chất lượng của bên thứ ba độc lập với ma trận càng gần vật liệu mẫu càng tốt cũng sẽ hỗ trợ thiết kế kiểm soát chất lượng vững chắc. Khi các xét nghiệm SARS-CoV-2 tiếp tục phát triển, nên tăng cường thực hành kiểm soát chất lượng để cung cấp các kết quả xét nghiệm tốt nhất có thể cho công chúng trong – và sau đại dịch này.
Tham khảo:
- Xét nghiệm trong phòng thí nghiệm để tìm bệnh do coronavirus 2019 (COVID-19) trong các trường hợp nghi ngờ ở người. Tổ chức Y tế Thế giới. WHO.int . https://apps.who.int/iris/bitstream/handle/10665/331329/WHO-COVID-19-laboratory-2020.4-eng.pdf . Ngày 2 tháng 3 năm 2020. Truy cập ngày 1 tháng 6 năm 2020.
- Danh sách kiểm tra vi sinh MIC 65200. Trường Cao đẳng Bệnh học Hoa Kỳ. CAP.org . https://elss.cap.org/elss/ShowProperty?nodePath=/UCMCON/Contribution%20Folders/DctmContent/education/OnlineCourseContent/2017/LAP-TLTM/checklists/cl-mic.pdf . Ngày 21 tháng 8 năm 2017. Truy cập ngày 1 tháng 6 năm 2020.
- Parvin, Curtis A. Kiểm soát chất lượng thống kê cho các thủ tục đo lường định lượng: Nguyên tắc và định nghĩa, Ấn bản lần thứ 4. KHOẢNG CÁCH . Năm 2020; C24 A4.
- Hướng dẫn Tạm thời về Thử nghiệm Kháng thể COVID-19 trong các Cơ sở Y tế Công cộng và Lâm sàng. Trung tâm Kiểm soát và Phòng ngừa Dịch bệnh. Ngày 23 tháng 5 năm 2020. Truy cập ngày 1 tháng 6 năm 2020.
- Phòng xét nghiệm y tế – Yêu cầu về phẩm chất và năng lực. Tổ chức Quốc tế về Tiêu chuẩn hoá. ISO.org. https://www.iso.org/obp/ui/#iso:std:56115:en . 2012. Truy cập ngày 1 tháng 6 năm 2020.
- Yundt-Pacheco J, Parvin CA. Xác nhận việc thực hiện các quy trình QC. Phòng thí nghiệm Clin Med . 2013; 33 (1): 75‐88. doi: 10.1016 / j.cll.2012.11.006
