[NCKH#29] Phương pháp phân tử trong chẩn đoán ung thư và thiết kế menu xét nghiệm phân tử

Giới thiệu

Chẩn đoán phân tử đã trở thành một công cụ quan trọng trong lĩnh vực ung thư học, giúp phân tích các thay đổi di truyền trong mẫu bệnh phẩm của bệnh nhân để hỗ trợ chẩn đoán và điều trị. Các phương pháp phân tử như giải trình tự (sequencing), lai phân tử (hybridization) và phản ứng chuỗi polymerase (PCR) được sử dụng rộng rãi để phát hiện các biến đổi di truyền, từ đột biến điểm, thay đổi số lượng bản sao đến các sự kiện tái sắp xếp gen. Bài viết này sẽ trình bày tổng quan về các phương pháp phân tử phổ biến, các yếu tố tiền phân tích (pre-analytical) quan trọng, và cách thiết kế một menu xét nghiệm phân tử hiệu quả dựa trên nhu cầu của cơ sở y tế. Những thông tin này được trích xuất từ tài liệu của Ewalt và Hsiao (2024), cung cấp cái nhìn chi tiết về ứng dụng lâm sàng và các yếu tố cần cân nhắc trong chẩn đoán phân tử.

Các yếu tố tiền phân tích trong xét nghiệm phân tử

Các yếu tố tiền phân tích, bao gồm thu thập mẫu, vận chuyển, lưu trữ và đánh giá mẫu, đóng vai trò quan trọng trong việc đảm bảo chất lượng xét nghiệm phân tử. Các loại mẫu thường gặp trong ung thư học phân tử bao gồm mô cố định bằng formalin và nhúng paraffin (FFPE), khối tế bào (cell blocks), phết tế bào (smears), máu, tủy xương và mô tươi hoặc đông lạnh. Mỗi loại mẫu đều yêu cầu các điều kiện xử lý đặc biệt để đảm bảo chất lượng DNA hoặc RNA.

Thu thập mẫu

Thời gian từ khi lấy mẫu đến khi bảo quản, được gọi là thời gian thiếu máu cục bộ (ischemic time), ảnh hưởng đáng kể đến chất lượng RNA. Các nghiên cứu cho thấy thời gian thiếu máu cục bộ kéo dài có thể làm giảm chất lượng và số lượng RNA, đặc biệt trong các xét nghiệm biểu hiện gen. Do đó, cần giảm thiểu thời gian này khi thực hiện các xét nghiệm dựa trên RNA. Đối với DNA, thời gian thiếu máu cục bộ ít ảnh hưởng hơn, nhưng vẫn cần xử lý nhanh chóng để đảm bảo chất lượng.

Cố định mô

Cố định mô bằng formalin trung tính 10% là tiêu chuẩn trong giải phẫu bệnh, giúp bảo quản mô bằng cách tạo liên kết chéo giữa DNA và protein. Tuy nhiên, các chất cố định khác như B5, Bouin hoặc Zenker không được khuyến cáo do gây tổn hại DNA. Thời gian cố định quá dài (hơn 72 giờ) có thể làm giảm chất lượng và số lượng DNA. Các mẫu tế bào học cố định bằng cồn, như phết tế bào hoặc khối tế bào, cũng có thể cung cấp DNA và RNA chất lượng cao cho xét nghiệm phân tử.

Khử canxi hóa

Việc khử canxi hóa mô có thể làm mẫu không sử dụng được cho xét nghiệm phân tử nếu sử dụng dung dịch chứa axit, do axit gây tổn hại và khử purin DNA. Dung dịch EDTA là lựa chọn thay thế an toàn hơn, không gây tổn hại DNA. Tùy thuộc vào kích thước sinh thiết, quá trình khử canxi hóa bằng EDTA có thể mất từ 16 đến 24 giờ đối với mẫu nhỏ, hoặc vài ngày đối với mẫu lớn hơn. Để đảm bảo khả năng xét nghiệm phân tử trong tương lai, nên bảo lưu một khối mô để khử canxi hóa bằng EDTA.

Lưu trữ và vận chuyển mẫu

Mô tươi hoặc chất lỏng cần được vận chuyển ngay đến phòng thí nghiệm và xử lý càng sớm càng tốt, đặc biệt đối với xét nghiệm dựa trên RNA. Các chất ổn định có thể được sử dụng để bảo quản mẫu trước khi chiết xuất axit nucleic. Đối với xét nghiệm DNA khối u tuần hoàn (ctDNA), mẫu máu cần được xử lý trong vòng 6 giờ nếu không sử dụng ống chứa chất ổn định tế bào. Lưu trữ lâu dài mô FFPE có thể dẫn đến phân mảnh DNA và khử amin cytosine, gây thất bại trong khuếch đại hoặc tạo ra lỗi trình tự.

Đánh giá mẫu

Trong xét nghiệm đột biến soma, việc đánh giá tỷ lệ tế bào khối u trong mẫu là cần thiết để đảm bảo biến thể khối u nằm trong giới hạn phát hiện của xét nghiệm. Tỷ lệ tế bào khối u không đủ có thể dẫn đến kết quả âm tính giả. Đánh giá này thường được thực hiện bằng cách xem xét thủ công các lát cắt nhuộm hematoxylin-eosin, hoặc sử dụng hình ảnh số để giảm tính chủ quan. Các kỹ thuật làm giàu tế bào khối u, như vi phẫu (microdissection) hoặc vi phẫu bằng laser (laser capture microdissection), thường được sử dụng để tăng tỷ lệ tế bào khối u.

Tối ưu hóa mẫu nhỏ

Đối với các mẫu nhỏ từ các kỹ thuật xâm lấn tối thiểu, việc tối ưu hóa mô là thách thức. Các chiến lược bao gồm nhúng các lõi mô vào các khối riêng, tránh cắt bỏ quá nhiều mô khi xử lý khối paraffin, và sử dụng tất cả các vật liệu có sẵn như phết tế bào, sinh thiết kim nhỏ hoặc ctDNA.

Các phương pháp phân tử

Các phương pháp phân tử tập trung vào phát hiện các thay đổi trong axit nucleic, được chia thành các nhóm dựa trên loại phân tử (DNA, RNA, protein) hoặc loại biến đổi (đột biến, biến thể cấu trúc, thay đổi số lượng bản sao, sửa đổi cộng hóa trị).

Phương pháp dựa trên DNA

Giải trình tự

• Sanger sequencing: Là phương pháp lâu đời, sử dụng các ddNTP để tạo ra các đoạn DNA có kích thước khác nhau, sau đó phân tích để xác định trình tự. Phương pháp này phù hợp cho các vùng mục tiêu nhỏ nhưng yêu cầu tỷ lệ tế bào khối u cao (20-40%) và không thể phát hiện các biến thể ở mức độ thấp.
• Giải trình tự thế hệ mới (NGS): NGS, hay giải trình tự song song khối lượng lớn, cho phép phân tích đồng thời nhiều vùng mục tiêu với độ nhạy cao (dưới 1%) nhờ sử dụng các định danh phân tử duy nhất (UMIs). NGS có chi phí cao hơn và yêu cầu nhiều DNA đầu vào, nhưng hiệu quả hơn về chi phí trên mỗi base so với Sanger khi phân tích vùng lớn.

Phương pháp không dựa trên giải trình tự

• Lai phân tử (FISH): Sử dụng các đầu dò DNA gắn huỳnh quang để phát hiện số lượng bản sao, điểm gãy hoặc sự kiện tái sắp xếp gen. FISH nhanh, nhạy, nhưng chỉ phát hiện được các biến thể cụ thể và không phù hợp cho các biến đổi nhỏ hoặc mới.
• Vi thể nhiễm sắc thể (CMA): Sử dụng các đầu dò cho hàng nghìn đến hàng triệu SNP để phát hiện thay đổi số lượng bản sao ở độ phân giải cao (15 kb). Tuy nhiên, CMA không phát hiện được các sự kiện chuyển vị cân bằng.
• Karyotyping: Phân tích toàn bộ bộ gen bằng cách nhuộm nhiễm sắc thể ở giai đoạn trung kỳ. Phương pháp này có độ phân giải thấp (10 Mb) và yêu cầu nuôi cấy tế bào, mất 3-7 ngày.
• PCR-based methods: Bao gồm PCR định lượng (qPCR) và PCR số (dPCR), có độ nhạy cao (1/10,000-100,000) và nhanh, nhưng chỉ phát hiện được các biến thể đã biết và có khả năng ghép kênh giới hạn.

Phương pháp dựa trên RNA

Xét nghiệm RNA bắt đầu bằng bước sao mã ngược để chuyển RNA thành cDNA, sau đó sử dụng các phương pháp phân tích DNA. Các xét nghiệm RNA đặc biệt hữu ích trong việc phát hiện các sự kiện tái sắp xếp gen và biến thể cắt nối (splice variants).

Thiết kế menu xét nghiệm phân tử

Thiết kế một menu xét nghiệm phân tử cần cân nhắc các yếu tố như biomarker, tỷ lệ xuất hiện, loại mẫu và hạn chế của phương pháp xét nghiệm. Ví dụ, trong ung thư phổi, các biomarker như EGFR, ALK, ROS1, BRAF, KRAS, ERBB2, MET, RET và NTRK yêu cầu kết hợp nhiều phương pháp (IHC, FISH, PCR, NGS). Các chiến lược bao gồm:

• Xét nghiệm tuần tự: Kiểm tra các biến thể phổ biến trước (như KRAS, EGFR), sau đó kiểm tra các biến thể hiếm hơn (như ALK, ROS1) nếu âm tính.
• Xét nghiệm toàn diện: Sử dụng NGS cho các trường hợp có gánh nặng di căn cao.
• Kết hợp với phòng thí nghiệm tham chiếu: Thực hiện các xét nghiệm phổ biến tại chỗ và gửi các xét nghiệm hiếm đến phòng thí nghiệm tham chiếu.

Các xét nghiệm được FDA phê duyệt hoặc tự phát triển trong phòng thí nghiệm (LDT) đều cần xác nhận hiệu suất trước khi sử dụng.

Kết luận

Chẩn đoán phân tử đóng vai trò quan trọng trong ung thư học, đòi hỏi sự chú trọng đến các yếu tố tiền phân tích và lựa chọn phương pháp phù hợp. Việc thiết kế menu xét nghiệm phân tử cần dựa trên nhu cầu lâm sàng, đặc điểm kỹ thuật của phương pháp và tính hiệu quả về chi phí. Với sự phối hợp chặt chẽ giữa các chuyên gia, các cơ sở y tế có thể xây dựng các chiến lược xét nghiệm hiệu quả, tối ưu hóa chẩn đoán và điều trị cho bệnh nhân ung thư.

Nguồn

Ewalt, M. D., & Hsiao, S. J. (2024). Molecular Methods: Clinical Utilization and Designing a Test Menu. Clinics in Laboratory Medicine, 44(2), 123-135. doi:10.1016/j.cll.2022.08.008

Trên đây là phần tóm lược nội dung của bài báo do QLAB biên dịch. Để xem đầy đủ nội dung vui lòng tham khảo bài báo gốc.

Thông tin bài báo khoa học:

Nếu bạn đang quan tâm nghiên cứu này hoặc cần bản gốc của nghiên cứu, hãy liên hệ Zalo: 0913.334.212 để được hỗ trợ.

Nếu bạn thấy bài viết mang lại giá trị cho mình, hãy mời chúng tôi ly cà phê bằng cách quét mã phía dưới nhé!