[NCKH#44] Những thách thức trước xét nghiệm của các xét nghiệm vi sinh phân tử

Giới thiệu

Một trong những câu nói phổ biến nhất trong y học phòng thí nghiệm là “garbage in, garbage out” (rác vào, rác ra). Câu nói này nhấn mạnh tầm quan trọng của các yếu tố tiền phân tích đối với chất lượng kết quả tổng thể. Việc giảm thiểu lỗi tiền phân tích là chìa khóa cho chương trình đảm bảo chất lượng phòng thí nghiệm, vì khoảng 46% đến 68,2% lỗi phòng thí nghiệm xảy ra ở giai đoạn này. Đối với xét nghiệm bệnh truyền nhiễm, các vấn đề tiền phân tích truyền thống tập trung vào việc đảm bảo lấy mẫu đầy đủ và duy trì tính sống của vi sinh vật. Tuy nhiên, với vai trò ngày càng lớn của phương pháp phân tử trong chẩn đoán vi sinh, việc duy trì tính sống của vi sinh vật có thể ít quan trọng hơn, nhưng mẫu phải không bị ô nhiễm bởi vi sinh vật hoặc axit nucleic. Hơn nữa, độ nhạy cao hơn của nhiều phương pháp phân tử so với nuôi cấy có thể định nghĩa lại khái niệm “lấy mẫu đầy đủ”, cho phép sử dụng các loại mẫu ít xâm lấn hơn.

Nhiều vấn đề tiền phân tích này đã được nhấn mạnh và tranh luận trong những ngày đầu của đại dịch COVID-19. Ví dụ: Que mũi có đủ nhạy cho xét nghiệm COVID-19 hay cần que ngoáy mũi họng (NP)? Có cần rửa phế quản phế nang (BAL) cho bệnh nhân nặng? Có thể dùng nước muối thay vì môi trường vận chuyển virus? Môi trường vận chuyển có thực sự cần thiết? Mẫu ổn định trong bao lâu? Có cần đông lạnh ngay lập tức hay chu kỳ đông-lạnh tan sẽ giảm độ nhạy?

Trong bài viết này, chúng ta sẽ khám phá một số yếu tố tiền phân tích có thể đặt ra thách thức cho xét nghiệm phân tử, bao gồm lựa chọn loại mẫu, quy trình lấy mẫu, thiết bị lấy mẫu, điều kiện lưu trữ và vận chuyển, cũng như quy trình xử lý mẫu.

Loại Mẫu Bệnh Phẩm

Khi chọn loại mẫu cho xét nghiệm phân tử, cần cân bằng giữa việc tối đa hóa độ nhạy và độ đặc hiệu với các yếu tố như sự thoải mái của bệnh nhân, sự chấp nhận của bệnh nhân, và rủi ro cũng như chi phí của việc lấy mẫu xâm lấn hơn. Mặc dù sự cân bằng này phụ thuộc vào mầm bệnh và bệnh nhân cụ thể, nhưng có dữ liệu cho nhiều hệ thống cơ thể.

Nhiễm trùng hô hấp trên

Một câu hỏi chính trong đại dịch COVID-19 là loại mẫu nào tối ưu và loại nào chấp nhận được. Que ngoáy NP truyền thống là lựa chọn hàng đầu cho nhiễm trùng hô hấp trên, nhưng chúng yêu cầu người lấy mẫu được đào tạo và có thể gây đau đớn cho bệnh nhân. Đối với xét nghiệm cúm dựa trên nuôi cấy, que mũi có độ nhạy thấp hơn que NP (40% so với 51%), nhưng sự khác biệt giảm khi sử dụng phương pháp phân tử. Tương tự, phát hiện adenovirus, virus hợp bào hô hấp (RSV), parainfluenza và virus cúm thấp hơn ở que mũi so với hút NP (thay thế phổ biến cho trẻ nhỏ) khi sử dụng nuôi cấy hoặc miễn dịch huỳnh quang; nhưng với PCR, năng suất chẩn đoán tương tự cho tất cả virus trừ RSV. Một đánh giá tài liệu về loại mẫu cúm cho xét nghiệm dựa trên PCR cho thấy hai mẫu ít xâm lấn kết hợp (như que miệng họng và mũi) có độ nhạy tương đương với que NP ở người lớn, và ở trẻ em, không có sự khác biệt thống kê giữa que NP, rửa NP, hút NP, que miệng họng hoặc que mũi.

Đối với SARS-CoV-2, một phân tích tổng hợp sử dụng que NP làm tiêu chuẩn vàng cho thấy que mũi và miệng họng kết hợp có độ nhạy tương đương với que NP, nhưng que mũi đơn lẻ và nước bọt cũng có độ nhạy chấp nhận được, trong khi que miệng họng không. Dữ liệu cho thấy que miệng họng có thể không lý tưởng cho người trên 60 tuổi vì tải lượng virus hô hấp cao gấp 19 lần ở mũi họng so với miệng họng ở nhóm này.

Sử dụng loại mẫu ít xâm lấn hơn được bệnh nhân ưa thích. Khi so sánh que NP và rửa mũi, 91% bệnh nhân thích rửa mũi, và độ nhạy lâm sàng không bị ảnh hưởng. Tương tự, bệnh nhân báo cáo sự khó chịu tương đương với hút mũi, rửa mũi và que mũi. Sử dụng loại mẫu ít xâm lấn (như que mũi hoặc nước bọt) cũng cho phép tự lấy mẫu mà không mất độ nhạy, ngay cả khi không được giám sát bởi nhân viên y tế.

Nhiễm trùng hô hấp dưới

Mặc dù nhiều nghiên cứu kiểm tra cách loại mẫu ảnh hưởng đến độ nhạy cho chẩn đoán phân tử nhiễm trùng hô hấp trên, nhưng dữ liệu cho mẫu hô hấp dưới rất ít. Dữ liệu từ nuôi cấy cho thấy sự phù hợp cao giữa nuôi cấy đờm và dịch BAL (93,7% mẫu lấy trong 1 ngày và 96,5% trong 7 ngày), mặc dù BAL có thể tăng độ nhạy khi chẩn đoán viêm phổi bệnh viện. Các nghiên cứu so sánh loại mẫu cho phương pháp phân tử tập trung vào Mycobacterium tuberculosis (MTB) và Pneumocystis jirovecii (PJP). Một nghiên cứu thực hiện PCR MTB trên cặp đờm và BAL từ 258 bệnh nhân nhiễm MTB âm tính phết. PCR trên BAL nhạy hơn trên đờm (41,9% so với 32,1%), nhưng kiểm tra cả hai mang lại năng suất chẩn đoán cao nhất (62,8%). Tương tự, kiểm tra BAL nhạy hơn đờm khi thực hiện PCR cho PJP ở bệnh nhân suy giảm miễn dịch (100% so với 86,6%).

Một nghiên cứu khám phá sự khác biệt loại mẫu khi sử dụng giải trình tự thế hệ mới metagenomic (mNGS). Trong nghiên cứu này, BAL và đờm được lấy từ 32 bệnh nhân, và cả hai đều trải qua mNGS. Không có sự khác biệt về độ nhạy hoặc độ đặc hiệu giữa loại mẫu khi so sánh kết quả với nuôi cấy. Cần thêm nghiên cứu để làm rõ sự khác biệt tiềm năng trong hiệu suất của các loại mẫu khác nhau cho chẩn đoán phân tử nhiễm trùng hô hấp dưới. Vì một bảng PCR multiplex được FDA phê duyệt hiện có sẵn cho cả mẫu hô hấp dưới xâm lấn và không xâm lấn, các nghiên cứu như vậy sẽ giúp tối đa hóa năng suất chẩn đoán trong khi giảm thiểu rủi ro và khó chịu cho bệnh nhân.

Bệnh lây truyền qua đường tình dục (STI)

Đối với chẩn đoán STI, có xu hướng mạnh mẽ hướng tới mẫu ít xâm lấn hoặc tự lấy. Vì chúng có thể không yêu cầu khám bộ phận sinh dục hoặc khung chậu, bệnh nhân có thể dễ chấp nhận hơn, và lấy mẫu có thể xảy ra tại vị trí tiện lợi hơn cho bệnh nhân, bao gồm nhà riêng. Đối với xét nghiệm STI ở phụ nữ, que nội cổ tử cung truyền thống là mẫu ưa thích vì các mẫu khác dẫn đến độ nhạy không chấp nhận được cho nuôi cấy Neisseria gonorrhoeae (NG). Khi sử dụng phương pháp phân tử, que âm đạo không kém hơn que nội cổ tử cung cho xét nghiệm Chlamydia trachomatis (CT) và NG. Mặc dù nước tiểu là loại mẫu ưa thích theo khảo sát bệnh nhân, một phân tích tổng hợp cho thấy que âm đạo có độ nhạy vượt trội (96,5% ở que âm đạo so với 90,7% ở nước tiểu cho NG; 94,1% ở que âm đạo so với 86,9% ở nước tiểu cho CT). Nghiên cứu cho thấy đối với Trichomonas vaginalis, sự khác biệt độ nhạy không đáng kể thống kê, mặc dù độ nhạy vượt trội cho que âm đạo có xu hướng đáng kể.

Đối với papillomavirus ở người (HPV), que nội cổ tử cung là loại mẫu tiêu chuẩn được sử dụng bởi hầu hết các xét nghiệm được FDA phê duyệt, có lẽ do sử dụng PCR HPV như xét nghiệm phản xạ từ Pap smear bất thường. Dù vậy, dữ liệu từ nhiều nghiên cứu cho thấy que âm đạo có độ nhạy tương đương so với que nội cổ tử cung, mặc dù tỷ lệ kết quả không hợp lệ có thể cao hơn với que âm đạo tự lấy. Đối với xét nghiệm STI ở nam giới, một phân tích tổng hợp cho thấy độ nhạy của mẫu nước tiểu so với que niệu đạo là 88% cho CT và 92% cho NG. Que niệu đạo liên quan đến đau trung bình đến nghiêm trọng ở bệnh nhân, vì vậy dù độ nhạy giảm, nước tiểu là loại mẫu khuyến nghị cho sàng lọc STI sinh dục ở nam giới.

Bệnh đường tiêu hóa

Phân khối là mẫu lịch sử được sử dụng cho nuôi cấy mầm bệnh đường ruột vi khuẩn, mặc dù que trực tràng có thể tiện lợi và chấp nhận hơn cho bệnh nhân vì không yêu cầu lấy phân tại nhà. Que trực tràng lịch sử có độ nhạy thấp hơn phân khối, mặc dù tiến bộ công nghệ que đã giảm thiểu sự khác biệt này gần đây. Các nghiên cứu khám phá sử dụng bảng GI trên que trực tràng cho thấy điều này nhạy như nuôi cấy que trực tràng và tương đương hiệu suất với bảng GI trên phân khối. Tương tự, khi sử dụng PCR đơn plex cho rotavirus và norovirus, hiệu suất tương đương giữa phân khối và que trực tràng. Mặc dù phân tích microbiome ruột chưa có sẵn như xét nghiệm lâm sàng, dữ liệu từ nhiều nghiên cứu gợi ý que trực tràng cũng có thể được sử dụng đáng tin cậy thay vì phân khối cho mục đích này.

Nhiễm trùng mô

Xét nghiệm phân tử mẫu mô chưa phổ biến vì không có phương pháp được FDA phê duyệt. Tuy nhiên, giải trình tự vi khuẩn và nấm phạm vi rộng có sẵn tại một số phòng thí nghiệm tham chiếu, và lựa chọn mẫu đúng là chìa khóa để tối đa hóa năng suất chẩn đoán trong khi giảm thiểu kết quả không đáng kể hoặc có thể gây nhầm lẫn. Khi xem xét giải trình tự nấm phạm vi rộng, một nghiên cứu cho thấy giải trình tự mô cố định formalin nhúng parafin (FFPE) ít nhạy hơn nuôi cấy nhưng giải trình tự mô tươi có độ nhạy tương đương. Mẫu từ cắt bỏ mở có năng suất chẩn đoán cao hơn hút kim nhỏ và sinh thiết. Khi kiểm tra mô FFPE, cả dương tính và tỷ lệ kết quả lâm sàng liên quan đều cao hơn đáng kể khi thấy yếu tố nấm trong slide bệnh lý; chỉ 3,0% mẫu mang lại phát hiện lâm sàng liên quan khi không thấy yếu tố nấm.

Nhiều nghiên cứu cho thấy mô khớp và mô tim có năng suất chẩn đoán cao nhất cho giải trình tự phạm vi rộng, trong khi năng suất với mẫu máu thấp, và mẫu hô hấp dưới liên quan đến tỷ lệ phát hiện không liên quan lâm sàng cao. Cần thêm nghiên cứu để xác định đầy đủ mẫu tốt nhất cho giải trình tự phạm vi rộng để tối đa hóa năng suất chẩn đoán.

Tóm tắt loại mẫu

Nói chung, phương pháp phân tử làm cho việc sử dụng loại mẫu ít xâm lấn hơn trở nên khả thi hơn so với phương pháp dựa trên nuôi cấy. Tuy nhiên, vẫn có sự khác biệt đáng kể về độ nhạy cho một số loại mẫu, vì vậy phán đoán lâm sàng là cần thiết để xác định loại mẫu phù hợp nhất. Sử dụng loại mẫu ít xâm lấn có thể đặc biệt hữu ích khi kết hợp với lấy mẫu tại nhà hoặc di động, chẳng hạn như cho STI hoặc trong bùng phát virus hô hấp. Cần thêm nghiên cứu để xác định loại mẫu lý tưởng vì nhiều bảng multiplex hơn, xét nghiệm giải trình tự Sanger, và xét nghiệm giải trình tự thế hệ mới có sẵn; vì các xét nghiệm này đắt hơn đáng kể và nhạy hơn phương pháp dựa trên nuôi cấy, lựa chọn loại mẫu phù hợp sẽ là chìa khóa cho quản lý chẩn đoán tốt nhất.

Thu Thập, Vận Chuyển và Xử Lý Mẫu

Xác định mẫu phù hợp cho xét nghiệm chỉ là nửa cuộc chiến. Duy trì sự ổn định của mẫu đó, và hạn chế ô nhiễm hoặc giới thiệu chất ức chế trong vận chuyển và xử lý là thiết yếu cho xét nghiệm vi sinh phân tử. Phòng thí nghiệm vi sinh trong mỗi cơ sở cần cung cấp hướng dẫn cho đội ngũ lâm sàng về thiết bị lấy và thể tích phù hợp, cũng như thời gian và điều kiện nhiệt độ mà mẫu sẽ ổn định đến khi nhận vào phòng thí nghiệm vi sinh lâm sàng. Xét nghiệm phân tử cũng dễ bị ức chế bởi phân tử nội sinh từ loại mẫu hoặc thiết bị lấy, nhưng cũng có thể được giới thiệu ngoại sinh. Sử dụng kỹ thuật vô trùng trong lấy và vận chuyển mẫu, quy định mẫu chia sẻ và ưu tiên mẫu dành riêng cho vi sinh là chiến lược tiền phân tích quan trọng để triển khai cho xét nghiệm phân tử. Tổng hợp, chúng có thể ngăn chặn cả kết quả dương tính giả và âm tính giả.

Chúng ta sẽ thảo luận về thách thức của lấy, vận chuyển và xử lý các loại mẫu được thảo luận trong phần “Loại Mẫu Bệnh Phẩm” trước. Có một số nguyên tắc chung áp dụng cho tất cả xét nghiệm phân tử bất kể loại mẫu mà quan trọng để xem xét trước khi đi sâu vào chi tiết. RNA thường dễ bị phân hủy hơn DNA do cấu trúc và sự phong phú của ribonuclease (RNase) trong môi trường, bao gồm trong vi sinh vật. Chất lượng RNA đã được chứng minh giảm nhanh như 24 giờ, trong khi chất lượng DNA vẫn nhất quán thậm chí sau 15 ngày. Gần đây, sinh thiết lỏng, dựa trên phát hiện DNA không tế bào lưu hành (cfDNA) từ vi sinh vật xâm lấn trong máu đã cho thấy tăng độ nhạy và độ đặc hiệu cho nhiều mầm bệnh. Áp dụng thực hành tốt nhất để bảo tồn tính toàn vẹn của axit nucleic trước phân tích là thiết yếu để có kết quả chính xác.

Thu thập và vận chuyển theo thùng chứa

Chất chống đông cho máu: Các nguyên tắc này đặc biệt được nhấn mạnh khi sử dụng máu và thành phần của nó cho xét nghiệm phân tử. Heparin được sử dụng rộng rãi cho lấy máu cho nhiều xét nghiệm nhưng lịch sử được biết là ức chế cho xét nghiệm phân tử. Có bằng chứng mới cho thấy heparin có thể không ảnh hưởng đến khuếch đại khi có lượng lớn DNA hoặc cho RNA nội bào. Dù vậy, heparin được tránh như chất phụ gia thùng chứa cho xét nghiệm phân tử. Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) và/hoặc acid citrate dextrose là chất phụ gia ưa thích cho máu khi cần xét nghiệm phân tử. EDTA hoạt động như chất chelat và ngăn nuclease phân hủy DNA. Tương tự, acid citrate dextrose ngăn chặn phân mảnh DNA và RNA, mang lại mẫu chất lượng cao hơn cho xét nghiệm phân tử. Giữ trong đầu sự ổn định khác nhau của RNA so với DNA hoặc bây giờ RNA/DNA không tế bào, thùng chứa lấy cụ thể cho analyte được đánh giá trong xét nghiệm phân tử. Nếu RNA nội bào được đo, ống lấy với chất ổn định RNA không chỉ ngăn phân hủy mà còn hạn chế thay đổi biểu hiện gen không mong muốn.

Các yếu tố khác như thời gian đến xử lý và nhiệt độ lưu trữ cũng thay đổi tùy theo thành phần, với mục tiêu giữ DNA/RNA ổn định nhất có thể. Các nghiên cứu cho thấy giảm thiểu ly giải tế bào tăng ổn định cfDNA. Đối với cfDNA, thành phần tế bào được tách khỏi pha lỏng càng sớm càng tốt. Một phân tích tổng hợp để xác định thời điểm cfDNA có thể ổn định tìm thấy câu trả lời đa dạng. Nó khuyến nghị máu nên được xử lý cho cfDNA trong vòng 6 giờ lấy trong ống EDTA, mặc dù các nghiên cứu trong phân tích thay đổi về ổn định từ 0 đến 24 giờ khi sử dụng ống EDTA. Ổn định được kéo dài đến 10 ngày trong các nghiên cứu khi thùng chứa có chất bảo quản ngăn ly giải bạch cầu ngoại vi. Đông lạnh máu toàn bộ không tăng ổn định và thậm chí làm hỏng RNA nhưng thành phần máu như huyết tương và huyết thanh có thể đông lạnh để duy trì tính toàn vẹn. Tủy xương có thể lạnh nhưng cần xử lý trong 72 giờ. Đông lạnh có thể kéo dài ổn định mẫu tủy xương nhưng chỉ nếu tế bào đỏ đã được loại bỏ để ngăn ly giải và giải phóng heme, ức chế xét nghiệm phân tử. Hướng dẫn chi tiết lấy và lưu trữ cần được phát triển cho tất cả loại mẫu khác nhau nhưng cũng xem xét analyte.

Chất cố định cho phân: Thùng vận chuyển cụ thể và điều kiện nhiệt độ có thể tăng tuổi thọ mẫu phân. Phân có vi sinh vật phong phú, làm cho nó là mẫu thách thức cho xét nghiệm phân tử. Chất cố định cần không chỉ để bảo tồn tính toàn vẹn của một số mầm bệnh mà còn để ức chế phát triển quá mức của hệ vi sinh vật bình thường và ngăn cắt axit nucleic. Chất cố định (formalin, sodium acetate-acetic acid-formalin [SAF], và polyvinyl alcohol viscosity thấp [LV-PVA]) được phát triển cho nuôi cấy phân và/hoặc xác định vi sinh vật bằng kính hiển vi có thể không luôn phù hợp cho xét nghiệm phân tử. Những chất cố định này có thể chứa chất ức chế cản trở trích xuất và khuếch đại axit nucleic hiệu quả trong mẫu. Chất ổn định DNA phân như ethanol 95% kinh tế hoặc chất cố định lọ đơn như Cary-Blair, Totalfix, và Ecofix cần để tiến hành xét nghiệm phân tử. Những chất cố định này không có chất ức chế, có thể ngăn phân hủy axit nucleic ngay cả khi lưu trữ dài hạn ở nhiệt độ phòng. Phân không bảo quản, tuy nhiên, có thể ảnh hưởng tiêu cực đến tính toàn vẹn của axit nucleic. Tuy nhiên, đáng lo ngại hơn là phát triển quá mức của hệ vi sinh vật bình thường, ảnh hưởng đáng kể đến độ nhạy phát hiện mầm bệnh ruột bằng xét nghiệm phân tử khi gánh nặng mầm bệnh thấp hoặc do tạo ra quá mức phân tử ức chế.

Các nghiên cứu cho thấy đông lạnh mẫu phân cũng có thể ức chế phát triển hệ vi sinh vật bình thường mà không ảnh hưởng đến chất lượng axit nucleic hiện diện. Do đó, nhiệt độ lưu trữ cùng với bảo quản phân trong chất cố định có thể tăng ổn định analyte trong mẫu phân đáng kể đặc biệt trong vận chuyển và trì hoãn xét nghiệm phân tử.

Que ngoáy: Que ngoáy thường không phải là mẫu ưa thích trong vi sinh nhưng chúng lý tưởng cho lấy mẫu má, NP, cổ tử cung, và niệu đạo. Không phải tất cả que đều giống nhau và không hoán đổi giữa các loại mẫu liệt kê. Que cotton hoặc cán gỗ không được khuyến nghị cho phát hiện bằng xét nghiệm phân tử, vì mẫu khó rửa giải, và cán gỗ có thể hấp thụ dung dịch rửa giải dẫn đến âm tính giả. Trong đại dịch, tuy nhiên, do thiếu hụt chuỗi cung ứng, những quan niệm này bị thách thức, và một số nghiên cứu tìm thấy không có sự khác biệt ý nghĩa giữa các loại que khác nhau. Nói chung, que dacron/nylon được ưa thích cho mẫu hô hấp ngay cả hơn que rayon tổng hợp. Que nên thường được vận chuyển trong môi trường vận chuyển virus ở 4°C trong vài ngày. Nếu mẫu cần lưu trữ lâu hơn, thì nên đặt ở -70°C để phục hồi tối ưu.

Phát hiện STI đã được cách mạng hóa ban đầu bởi xét nghiệm phân tử nhưng cũng bởi sự dễ dàng, linh hoạt, và riêng tư của tự lấy mẫu. Hơn nữa, tự lấy có khả năng tiếp cận dân số có nguy cơ cao nhất cho STI. Dễ dàng vận chuyển và điều kiện lưu trữ đặc biệt quan trọng cho mẫu tự lấy. Các nghiên cứu khác nhau cho thấy đối với phát hiện hầu hết STI, cả que khô và que vận chuyển trong môi trường lỏng đều tương đương. Ổn định axit nucleic trong mẫu lấy que có thể thay đổi theo điều kiện lưu trữ và phụ thuộc vào mầm bệnh DNA so với RNA. Mầm bệnh DNA cứng cáp hơn và có thể ổn định đến một tháng ở nhiệt độ phòng cho HPV, trong khi virus hô hấp ổn định chỉ 4 ngày ở 4°C. Xét nghiệm mẫu từ que luôn thách thức nhưng ESwabs (Copan Diagnostics Inc., Murrieta, CA) đã cách mạng hóa lấy mẫu trên que. ESwabs là que flocked đi kèm 1 mL Liquid Amies cho phép cải thiện lấy mẫu và rửa giải. Nó cũng chuẩn hóa thể tích mẫu mỗi lấy.

Kết luận

Các thách thức tiền phân tích trong xét nghiệm vi sinh phân tử nhấn mạnh nhu cầu cẩn thận trong lựa chọn, lấy, vận chuyển và xử lý mẫu để đảm bảo kết quả chính xác. Phương pháp phân tử cho phép sử dụng mẫu ít xâm lấn hơn, nhưng vẫn cần nghiên cứu thêm để tối ưu hóa, đặc biệt với các công nghệ mới như mNGS. Việc tuân thủ các thực hành tốt nhất sẽ giúp giảm lỗi và cải thiện chẩn đoán.

Nguồn: Misra, A., & Powell, E. A. (2024). Preanalytical Challenges of Molecular Microbiology Tests. Clin Lab Med, 44, 33–43. https://doi.org/10.1016/j.cll.2023.10.007

Trên đây là phần tóm lược nội dung của bài báo do QLAB biên dịch. Để xem đầy đủ nội dung vui lòng tham khảo bài báo gốc.

Thông tin bài báo khoa học:

Nếu bạn đang quan tâm nghiên cứu này hoặc cần bản gốc của nghiên cứu, hãy liên hệ Zalo: 0913.334.212 để được hỗ trợ.