[NCKH#46] Kỹ thuật phân tử và đột biến gen trong hội chứng loạn sản tủy

Giới thiệu

Hội chứng loạn sản tủy (MDS), nay còn được gọi là u ác tính loạn sản tủy, là một nhóm bệnh lý huyết học đa dạng về mặt sinh học và lâm sàng, đặc trưng bởi hình thái loạn sản, thiếu máu ngoại vi và khả năng chuyển dạng thành bạch cầu cấp dòng tủy (AML). Hai hệ thống phân loại MDS mới nhất: một là Phân loại Tổ chức Y tế Thế giới về U Huyết học (WHO-HAEM5), và hai là Phân loại Đồng thuận Quốc tế (ICC) do Hội Vi Sinh học Bệnh học và Hiệp hội Châu Âu về Vi Sinh học Bệnh học hình thành, nhấn mạnh sự hiểu biết ngày càng tăng về MDS như một bệnh lý được định nghĩa bởi yếu tố di truyền. Điều này khác biệt so với các hệ thống trước đây, nơi MDS được phân loại chủ yếu dựa trên đặc điểm hình thái hoặc nguy cơ tiến triển thành AML. Các tổn thương di truyền trong MDS có thể là di truyền, phát sinh tự phát hoặc do tiếp xúc với môi trường, bao gồm hóa trị độc tế bào và xạ trị. Đôi khi, chúng mang ý nghĩa tiên lượng và lâm sàng, hướng dẫn lựa chọn các chất chống ung thư nhắm mục tiêu, hỗ trợ phân tầng nguy cơ và có thể được sử dụng để theo dõi bệnh tồn dư sau điều trị ban đầu. Mặc dù MDS phổ biến nhất ở người lớn tuổi (tuổi trung vị tại chẩn đoán là 77 tuổi), bệnh có thể xảy ra ở mọi lứa tuổi. Thảo luận chi tiết về đột biến dòng mầm và MDS ở trẻ em (còn gọi là thiếu máu kháng trị ở trẻ em) có thể tìm thấy ở các bài viết khác trong loạt đánh giá này. Bài thảo luận hiện tại tập trung chủ yếu vào các đột biến di truyền mắc phải liên quan đến MDS ở người lớn.

Kiểm Tra Phân Tử Trong Hội Chứng Loạn Sản Tủy

Đánh giá ban đầu của bệnh nhân nghi ngờ MDS bao gồm công thức máu toàn bộ; lam máu ngoại vi; và đánh giá tủy xương bao gồm đánh giá hình thái, miễn dịch hóa mô, phân tích di truyền tế bào và kiểm tra phân tử, với hoặc không có lưu lượng tế bào đa tham số (MFC). Các phương pháp phân tích di truyền tế bào bao gồm karyotype, lai huỳnh quang tại chỗ (FISH) và microarray nhiễm sắc thể (CMA), trong khi kiểm tra đột biến gen cụ thể truyền thống bao gồm giải trình tự Sanger và phản ứng chuỗi polymerase (PCR), với giải trình tự thế hệ mới (NGS) đóng vai trò ngày càng quan trọng.

Phân Tích Di Truyền Tế Bào

Karyotype (tức là dải nhiễm sắc thể) là phương pháp cổ nhất và được sử dụng nhiều nhất để đánh giá các bất thường nhiễm sắc thể bao gồm số lượng bản sao và bất thường cấu trúc do tính sẵn có rộng rãi và tỷ lệ thành công cao đã được chứng minh từ những năm 1980. Nó bị hạn chế bởi độ phân giải kém trong việc phát hiện các bất thường nhỏ hơn 10 Mbases, độ nhạy phân tích thấp là 10⁻¹ (bất thường hiện diện ở 5%-10% tế bào), và nhu cầu phân tích các tế bào nuôi cấy phân chia in vitro, vì việc thu được đủ tế bào trung kỳ trong nuôi cấy không phải lúc nào cũng khả thi ở một số bệnh lý huyết học ác tính. Thời gian trả kết quả có thể nhanh chóng chỉ trong 48 giờ nhưng thường mất 2-3 tuần, tùy thuộc vào thực hành phòng thí nghiệm cá nhân.

FISH vượt qua yêu cầu sử dụng tế bào phân chia nuôi cấy, vì nó có thể được sử dụng trên tế bào cố định hoặc tế bào liên kỳ. Nó thể hiện độ nhạy phân tích lớn hơn (10⁻²; bất thường hiện diện ở 1%-5% tế bào) so với karyotype và có độ phân giải cao hơn để phát hiện các bất thường nhiễm sắc thể ở mức độ gen bị bỏ lỡ bởi karyotype thông thường, mặc dù trong một nghiên cứu trên 544 mẫu tủy xương thu được để chẩn đoán và 364 mẫu thu được để theo dõi MDS, karyotype và FISH phù hợp 98,3% thời gian tại chẩn đoán và 97% thời gian tại theo dõi. Trong khi karyotype cho phép đánh giá toàn bộ bộ gen, các đầu dò FISH phải nhắm đến gen hoặc vùng quan tâm và hạn chế hầu hết các phòng thí nghiệm lâm sàng sử dụng các đầu dò thương mại có sẵn. Nó thường nhanh hơn karyotype, thường hoàn thành trong 1-3 ngày.

CMA không yêu cầu tế bào nuôi cấy và thể hiện độ phân giải nâng cao (khoảng 25-50 Kbases) để phát hiện các bất thường không cân bằng so với karyotype. Ngoài ra, chúng có thể hình dung mất tính dị hợp tử trung tính số lượng bản sao, không thấy trên karyotype. CMA cung cấp lợi thế so với FISH ở chỗ chúng không yêu cầu đầu dò nhắm mục tiêu và có thể phát hiện bất thường trên toàn bộ bộ gen theo cách tiếp cận không thiên vị. Chúng bị hạn chế bởi độ nhạy phân tích kém hơn so với karyotype và FISH (>10⁻¹; bất thường hiện diện ở 20%-30% tế bào), không khả năng phát hiện các sắp xếp lại cân bằng thường thấy trong bệnh lý huyết học ác tính, và chi phí cao hơn. Thời gian trả kết quả cho CMA thường dài hơn FISH hoặc karyotype, dao động từ 3 đến 14 ngày, và có thể không sẵn có thường quy.

Kiểm Tra Phân Tử

PCR truyền thống, hoặc định tính, cho phép phát hiện các đột biến gen cụ thể hoặc kết hợp thông qua sao chép enzyme của axit deoxyribonucleic (DNA) sau đó được phân tích bằng các phương pháp như điện di gel hoặc mao quản. PCR định tính chỉ cảnh báo về sự hiện diện hoặc vắng mặt của đột biến mục tiêu, trong khi PCR thời gian thực định lượng chỉ định lượng lượng mục tiêu hiện diện trong mẫu bằng cách đo lường khuếch đại PCR khi nó xảy ra. PCR kỹ thuật số (dPCR) số hóa hỗn hợp PCR khối thành hàng nghìn microreaction kích thước nanoliter có thể được kiểm tra độc lập sử dụng phần mềm thống kê để xác định lượng lượng mục tiêu DNA với độ chính xác ngày càng vượt trội (10⁻⁴; một đột biến trong 10.000 tế bào bình thường). Thời gian trả kết quả PCR thường là 3-5 ngày.

Giải trình tự Sanger cho phép phân tích chi tiết các đoạn PCR để phát hiện các biến thể nhỏ (<1 kb) bằng cách kết hợp các dideoxynucleotide được gắn nhãn huỳnh quang trong quá trình sao chép DNA sau đó được phát hiện bằng điện di. Nó có lợi thế về thời gian trả kết quả tương đối nhanh nhưng bị hạn chế bởi chi phí cao, cường độ lao động, độ nhạy phân tích hạn chế (10⁻¹; bất thường phải hiện diện ở ít nhất 20% tế bào), và yêu cầu giải thích chuyên gia trong trường hợp đột biến phức tạp hoặc bất thường. Giải trình tự Sanger được sử dụng để phát hiện đột biến trong một exon đơn lẻ như CEBPA và hữu ích trong việc xác nhận kết quả sàng lọc PCR, xác định các biến thể dòng mầm tiềm năng, phát hiện các thay thế cơ sở cụ thể bị bỏ lỡ bởi PCR, hoặc phân biệt giữa các đột biến lành tính và gây bệnh chọn lọc dẫn đến kết quả tương tự trong các xét nghiệm dựa trên PCR.

NGS cho phép đánh giá đồng thời nhiều gen với độ nhạy cao thông qua phân tích hàng triệu đến hàng tỷ phản ứng giải trình tự chạy song song. NGS có thể được sử dụng để phát hiện cả bất thường phân tử nhỏ và lớn bao gồm biến thể nucleotide đơn, chèn/xóa nhỏ (indels) và tùy thuộc vào thiết kế, cũng có thể xác định thay đổi số lượng bản sao, kết hợp gen hoặc chuyển vị nhiễm sắc thể, biểu hiện gen và methyl hóa DNA. Nó có thể đánh giá nhiều gen đồng thời (bảng gen nhắm mục tiêu; phương pháp NGS phổ biến nhất trong phòng thí nghiệm lâm sàng), nhiều vùng gen đồng thời (giải trình tự toàn bộ exome), toàn bộ bộ gen (giải trình tự toàn bộ bộ gen [WGS]), hoặc toàn bộ transcriptome (giải trình tự toàn bộ transcriptome). NGS là phương pháp bán định lượng, biểu thị tỷ lệ mẫu bị ảnh hưởng bởi một đột biến nhất định dưới dạng tần số allele biến thể (VAF) với độ nhạy phân tích điển hình là 2%-5%. NGS bị hạn chế bởi chi phí cao, cường độ lao động và sự khác biệt giữa phòng thí nghiệm trong đo lường VAF, đánh giá tính gây bệnh của biến thể và xác định tình trạng dòng mầm so với soma của đột biến. Các hướng dẫn của hội chuyên môn có sẵn để hỗ trợ chuẩn hóa báo cáo kết quả NGS. Thời gian trả kết quả thường là 5-14 ngày.

Một số phương pháp phân tử và di truyền tế bào hữu ích trong theo dõi bệnh tồn dư tối thiểu (MRD) sau liệu pháp ban đầu trong MDS và các bệnh lý ác tính myeloid khác. Phương pháp ít nhạy nhất có sẵn là FISH, với độ nhạy phân tích là 10⁻² để phát hiện các chuyển vị đã xác định trước đó như RUNX1::RUNX1T1. PCR định lượng có thể được sử dụng để phát hiện các bất thường phân tử đã biết với độ nhạy phân tích cao hơn là 10⁻⁴ đến 10⁻⁵. dPCR vẫn còn khám phá trong theo dõi MRD, và việc sử dụng NGS cho mục đích này bị hạn chế bởi ngưỡng VAF chưa được định nghĩa cho bệnh tồn dư giữa các đột biến khác nhau, thiếu chuẩn hóa giữa phòng thí nghiệm về kỹ thuật theo dõi MRD, và thách thức trong việc phân biệt bệnh tồn dư với tạo máu vô tính tiền ác tính (CH).

Việc lựa chọn công nghệ nhất định cho kiểm tra phân tử dựa trên nhiều yếu tố bao gồm loại và số lượng bất thường phân tử được kiểm tra, mục tiêu kiểm tra (tức là chẩn đoán so với theo dõi bệnh), chi phí kiểm tra, ràng buộc thời gian, lao động và vật tư có sẵn trong phòng thí nghiệm lâm sàng, và tính sẵn có của các nhà bệnh lý học chuyên gia để giải thích các phát hiện cụ thể. Các kỹ thuật khác nhau tốt nhất được sử dụng song song, chẳng hạn như tối đa hóa độ nhạy của các xét nghiệm dựa trên PCR hoặc NGS trong khi sử dụng phạm vi rộng của các đột biến có thể phát hiện bởi giải trình tự Sanger.

Kết luận

MDS ngày càng được hiểu là một bệnh lý được định nghĩa bởi gen, với các đột biến gen nay định nghĩa một số phân loại phụ của MDS dựa trên các hệ thống phân loại mới nhất. Đột biến gen hiện diện ở hầu hết các trường hợp MDS và thường có ý nghĩa tiên lượng và lâm sàng. Tiến bộ trong công nghệ giải trình tự DNA cho phép cá nhân hóa lớn hơn trong chẩn đoán và quản lý MDS. Các nỗ lực đang diễn ra để tích hợp vào thực hành lâm sàng một công cụ đánh giá nguy cơ MDS chuẩn hóa bao gồm dữ liệu phân tử.

Nguồn: Mendoza, H., & Siddon, A. J. (2023). Molecular Techniques and Gene Mutations in Myelodysplastic Syndromes. Clin Lab Med, 43, 549–563. https://doi.org/10.1016/j.cll.2023.06.002

Trên đây là phần tóm lược nội dung của bài báo do QLAB biên dịch. Để xem đầy đủ nội dung vui lòng tham khảo bài báo gốc.

Thông tin bài báo khoa học:

Nếu bạn đang quan tâm nghiên cứu này hoặc cần bản gốc của nghiên cứu, hãy liên hệ Zalo: 0913.334.212 để được hỗ trợ.