Ứng dụng Khối phổ trong Vi sinh lâm sàng – Phần 1

Giới thiệu

Trong thập kỷ qua, khối phổ kế ion hóa giải hấp phụ laser hỗ trợ ma trận thời gian bay (MALDI-TOF MS) đã đánh dấu một bước ngoặt quan trọng trong vi sinh lâm sàng, thay đổi cách thức xác định vi sinh vật trong các phòng xét nghiệm y tế. Từ một lĩnh vực vốn dựa vào các phương pháp sinh hóa chậm chạp, vi sinh lâm sàng đã chứng kiến sự chuyển mình mạnh mẽ nhờ công nghệ khối phổ, đặc biệt là MALDI-TOF, với khả năng nhận diện nhanh chóng và chính xác các vi khuẩn, nấm men, và thậm chí cả nấm mốc và vi khuẩn kháng axit. Bài viết này, dựa trên nghiên cứu của Weiss và Basu (2025), sẽ phân tích lịch sử phát triển, ứng dụng hiện tại, và những thách thức của MALDI-TOF MS trong vi sinh lâm sàng.

Lịch sử phát triển của khối phổ và vi sinh lâm sàng

Nguồn gốc của vi sinh học và khối phổ

Vi sinh học hiện đại bắt nguồn từ thế kỷ 17, khi Leeuwenhoek lần đầu tiên quan sát vi khuẩn dưới kính hiển vi. Trong hơn hai thế kỷ, việc xác định vi sinh vật chủ yếu dựa trên quan sát hình thái hoặc đặc điểm sinh hóa, sử dụng các phản ứng enzyme hoặc lên men. Đến những năm 1970-1980, các nền tảng xác định sinh hóa tự động đã ra đời, sử dụng hàng chục phản ứng để phân loại vi khuẩn, nhưng vẫn tốn thời gian và công sức.

Trong khi đó, khối phổ (MS) cũng có lịch sử lâu đời từ cuối thế kỷ 19, nhưng chủ yếu được ứng dụng trong hóa học và vật lý. Các kỹ thuật ion hóa mạnh (hard ionization) như ion hóa va chạm electron gây phân mảnh các phân tử sinh học, khiến khối phổ không phù hợp cho nghiên cứu sinh học cho đến những năm 1980. Một bước đột phá quan trọng xảy ra vào năm 1975, khi Anhalt và Fenselau sử dụng khối phổ nhiệt phân để xác định vi khuẩn gram âm, đánh dấu bước đầu tiên trong việc kết hợp khối phổ với vi sinh học.

Sự ra đời của ion hóa mềm và MALDI-TOF

Sự phát triển của các kỹ thuật ion hóa mềm như ion hóa phun điện (ESI) và ion hóa giải hấp phụ laser hỗ trợ ma trận (MALDI) vào cuối những năm 1980 đã mở ra một kỷ nguyên mới. MALDI, được phát triển bởi Hillenkamp và Karas, cho phép ion hóa các phân tử lớn như protein mà không làm chúng phân mảnh. Công trình của Koichi Tanaka, người đoạt giải Nobel Hóa học năm 2002, đã chứng minh khả năng ion hóa các phân tử sinh học lớn hơn 30 kDa, đặt nền móng cho phân tích proteomic kiểu “từ trên xuống” (top-down). Sự kết hợp của MALDI với phân tích thời gian bay (TOF) đã tạo ra một công cụ lý tưởng cho việc xác định vi sinh vật nhờ khả năng phân tích các protein nguyên vẹn trong phạm vi khối lượng lớn.

Ứng dụng của MALDI-TOF trong vi sinh lâm sàng

Quy trình làm việc của MALDI-TOF

Quy trình MALDI-TOF để xác định vi sinh vật bao gồm các bước sau:

1. Lấy mẫu vi sinh vật từ môi trường nuôi cấy (ví dụ: đĩa thạch máu).

2. Đặt mẫu lên bề mặt thép dẫn điện.

3. Thêm ma trận hóa học (thường là axit cyano-4-hydroxycinnamic, CHCA) hòa tan trong dung môi hữu cơ.

4. Đưa mẫu vào nguồn ion MALDI, đặt trong môi trường chân không.

5. Sử dụng laser tần số cao để kích thích ma trận và protein vi sinh vật.

6. Các protein được ion hóa và di chuyển qua phân tích TOF dựa trên tỷ lệ khối lượng trên điện tích (m/z).

7. Phổ khối lượng được tạo ra và so sánh với cơ sở dữ liệu để xác định vi sinh vật.

Quy trình này nhanh hơn đáng kể so với các phương pháp sinh hóa truyền thống, thường chỉ mất vài phút thay vì hàng giờ hoặc ngày, đồng thời giảm chi phí và nhu cầu đào tạo phức tạp.

Xác định vi khuẩn

MALDI-TOF đã được áp dụng rộng rãi cho việc xác định vi khuẩn từ năm 2013, khi các hệ thống như MALDI Biotyper (Bruker) và VITEK MS (bioMérieux) được FDA phê duyệt. Hai hệ thống này sử dụng ma trận CHCA và quy trình tương tự, nhưng khác nhau về thuật toán phân tích: MALDI Biotyper sử dụng phương pháp so khớp mẫu, trong khi VITEK MS dựa trên học máy. Cả hai đều có khả năng nhận diện hơn 400 loài vi khuẩn, chủ yếu dựa trên các protein ribosome, vốn ít chịu áp lực tiến hóa, giúp phân biệt chính xác các loài.

Tuy nhiên, hạn chế bao gồm việc khó phân biệt các loài gần gũi về mặt di truyền như Escherichia coli và Shigella spp., hoặc Brucella và Ochrobactrum spp., đòi hỏi các phương pháp bổ sung như kiểm tra khả năng di động hoặc lên men lactose.

Xác định nấm men

Việc xác định nấm men bằng MALDI-TOF cũng tương tự, nhưng yêu cầu thêm bước xử lý bằng axit formic để phá vỡ thành tế bào cứng của nấm men. Phương pháp này đã cải thiện đáng kể độ chính xác so với các kỹ thuật sinh hóa truyền thống, vốn thường gây nhầm lẫn. Tuy nhiên, các loài mới như Candida auris ban đầu không có trong cơ sở dữ liệu IVD, dẫn đến nhầm lẫn với Candida haemulonii, nhấn mạnh tầm quan trọng của việc cập nhật cơ sở dữ liệu.

Xác định vi khuẩn kháng axit và nấm mốc

Việc xác định vi khuẩn kháng axit (Mycobacteria, Nocardia) và nấm mốc gặp nhiều thách thức hơn do lớp vỏ lipid hoặc thành tế bào cứng. Đối với Mycobacteria, cần các bước tiền xử lý như bất hoạt bằng ethanol và chiết xuất protein bằng axit formic. Tương tự, nấm mốc đòi hỏi các bước phức tạp hơn như ly tâm và xử lý bằng axit formic để giải phóng protein nội bào. Dù vậy, MALDI-TOF vẫn cho phép rút ngắn thời gian xác định từ vài tuần xuống vài ngày, nhưng cơ sở dữ liệu cần được mở rộng để bao gồm các loài mới.

Thách thức và hạn chế

Mặc dù mang tính cách mạng, MALDI-TOF vẫn có những hạn chế:

• Vi khuẩn gần gũi về di truyền: Các loài như E. coli và Shigella hoặc Brucella và Ochrobactrum khó phân biệt do sự tương đồng trong protein ribosome.

• Cơ sở dữ liệu hạn chế: Các cơ sở dữ liệu IVD có thể không bao gồm các loài mới hoặc ít gặp, như Candida auris trước khi được cập nhật.

• Yêu cầu xử lý phức tạp: Đối với Mycobacteria và nấm mốc, các bước tiền xử lý tăng nguy cơ an toàn sinh học và đòi hỏi thiết bị chuyên dụng.

• Nguồn lực hạn chế: Các phòng xét nghiệm nhỏ có thể thiếu tài nguyên để xây dựng cơ sở dữ liệu nội bộ hoặc thực hiện xác nhận.

Kết luận

Sự ra đời của MALDI-TOF MS đã đánh dấu một cuộc cách mạng trong vi sinh lâm sàng, thay thế các phương pháp sinh hóa chậm chạp bằng một công cụ nhanh, chính xác và tiết kiệm chi phí. Với khả năng xác định vi khuẩn, nấm men, vi khuẩn kháng axit và nấm mốc, công nghệ này đã trở thành tiêu chuẩn trong các phòng xét nghiệm hiện đại. Tuy nhiên, để tối ưu hóa hiệu quả, cần tiếp tục cải tiến cơ sở dữ liệu, đơn giản hóa quy trình xử lý, và tích hợp với các công nghệ khác như giải trình tự gen. Trong tương lai, việc mở rộng ứng dụng của MALDI-TOF cho virus và ký sinh trùng hứa hẹn sẽ tiếp tục thay đổi cách thức chẩn đoán vi sinh lâm sàng, mang lại lợi ích to lớn cho chăm sóc sức khỏe toàn cầu.

Nguồn: Weiss, R. F., & Basu, S. K. (2025). The Mass Spectrometry Revolution in Clinical Microbiology. Clinical Laboratory Medicine, 45, 1-13.

Thông tin bài báo khoa học:

Nếu bạn đang quan tâm bài báo này hoặc cần bản gốc của bài báo, hãy liên hệ Zalo 0913.334.212 để được hỗ trợ.

Nếu bạn thấy bài viết mang lại giá trị cho mình, hãy mời chúng tôi ly cà phê bằng cách quét mã phía dưới nhé!